簡介：

圖1 .Countstar®F Rigel系統結合數字顯微鏡和圖像分(fēn)析功能(néng)的台面設備

儀器和材料：

1.  Countstar Rigel 細胞分(fēn)析儀

2.  Countstar 樣品闆

3.  0.2% 台盼藍染色液(CS0101001-50)

4.  CHO 細胞系

5.  DMEM 細胞培養基(Hyclone-SH30243.01) 胎牛血清(Hyclone-SH30084.03) 胰蛋白酶(Hyclone-SH30042.01)。其中(zhōng)，CHO 細胞系穩定表達 X 蛋白，用(yòng)于評價原研藥和仿制藥的親和力一抗：不同濃度梯度的 002-BMK1,002-BMK2,AB1, AB2, AB3, AB4, AB5, AB6, AB7, AB8, AB9, PCSK-9。其中(zhōng)，002-BMK1,002-BMK2 能(néng)特異性的與 X 蛋白結合（陽性抗體(tǐ)），PCSK-9 是陰性對照抗體(tǐ)。二抗：Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG(Biolegend) ，5µg/mL

6.  軟件  GraphPad Prism5®

方法：

細胞培養條件

1.    CHO細胞培養在完全培養基中(zhōng)，組成為(wèi)：500mLDMEM培養基，2mML-谷氨酰胺,1.5g/L碳酸氫鈉和10%胎牛血清。于37°C,5%CO2培養箱中(zhōng)培 養48 小(xiǎo)時；

2.    消化收集細胞。

染色步驟

1、使用(yòng)台盼藍計數測定細胞濃度；

2、準備3*10^5 個細胞/每個反應；

3、細胞樣品于400g下離心3-5 分(fēn)鍾，去上清，用(yòng)100µLPBS重懸；

4、輕輕混勻細胞樣品，于 400g 下離心 3-5 分(fēn)鍾，去上清，用(yòng) 100µL Cellstaining buffer 重懸；

5、在細胞樣品中(zhōng)加入不同濃度梯度的一抗，每種抗體(tǐ)最高濃度為(wèi) 10µg/mL，4

倍梯度稀釋，最低濃度為(wèi) 0.01µg/mL；

6、37℃下，避光孵育 60 分(fēn)鍾；

7、細胞樣品于400g 下離心 3-5 分(fēn)鍾，去上清，用(yòng) 100µL PBS重懸；

8、輕輕混勻細胞樣品，于 400g 下離心 3-5 分(fēn)鍾，去上清，用(yòng) 100µL Cellstaining buffer 重懸；

9、在每個反應組内加入 5µg/mL 二抗；

10、常溫下，避光孵育 30 分(fēn)鍾；

11、細胞樣品于400g 下離心 3-5 分(fēn)鍾，去上清，用(yòng) 100µL PBS重懸；

12、輕輕混勻細胞樣品，于 400g 下離心 3-5 分(fēn)鍾，去上清，用(yòng) 100µL Cellstaining buffer 重懸；

13、混勻樣品，加入 20µL 于細胞計數闆中(zhōng)，上機檢測。注：以上操作(zuò)可(kě)使用(yòng) EP 管或 96 孔闆。

不同抗體(tǐ)梯度稀釋添加劑量

選用(yòng)96孔闆測定不同抗體(tǐ)與CHO細胞反應的劑量效應實驗，包括原研藥、抗體(tǐ)藥和陰性對照（圖2）。一抗濃度按照下表指示梯度降低(10µg/mL-0.01µg/mL)。

圖2. 96 孔闆中(zhōng)抗體(tǐ)濃度. 每孔中(zhōng)有(yǒu)CHO細胞（30 萬個），二抗(5µg/mL)及圖示 一抗(0.01, 0.039, 0.156, 0.625, 2.5, 10µg/mL).其他(tā)孔為(wèi)空.

圖 4. 抗體(tǐ)親和力定量分(fēn)析結果.A.不同濃度梯度抗體(tǐ)下不同抗原抗體(tǐ)反應中(zhōng)平均熒光強度.B.原研藥和仿制藥的分(fēn)析結果比較