細胞凋亡
1.細胞凋亡的概念
細胞凋亡（Cell apoptosis）是一個主動的由基因決定的細胞自動結束生命的過程，是細胞為(wèi)維持内環境穩定而有(yǒu)序性地死亡，它涉及一系列基因的激活、表達和調控等作(zuò)用(yòng)，具(jù)有(yǒu)生理(lǐ)性和選擇性的。
2.細胞凋亡的特征
（1）形态學(xué)變化：最初細胞體(tǐ)積縮小(xiǎo)，細胞間接觸消失，與周圍細胞脫離；之後是細胞質(zhì)密度增加，核質(zhì)濃縮，核膜、核仁破裂，胞膜有(yǒu)小(xiǎo)泡形成，胞膜結構依舊完整，最終可(kě)将凋亡細胞分(fēn)割包裹成幾個凋亡小(xiǎo)體(tǐ)，無内容物(wù)外溢；凋亡小(xiǎo)體(tǐ)可(kě)以被周圍專職或非專職的吞噬細胞吞噬。
（2）生物(wù)學(xué)變化：DNA發生有(yǒu)控降解，片段化的DNA片段為(wèi)180-200bp的整倍數；在細胞凋亡的過程中(zhōng)，也常有(yǒu)新(xīn)的基因的表達和某些生物(wù)大分(fēn)子的合成作(zuò)為(wèi)調控因子。
3.細胞凋亡的生理(lǐ)意義
（1）維持多(duō)細胞生物(wù)個體(tǐ)發育的正常進行；
（2）保持自穩平衡；
（3）抵禦外界各種因素的幹擾。
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細胞凋亡的檢測方法
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1.形态學(xué)觀察
根據凋亡細胞固有(yǒu)的形态特征，用(yòng)台盼藍、DAPI或Giemsa染色，然後在光學(xué)顯微鏡下觀察，或直接在電(diàn)鏡下觀察。
2.DNA片段化檢測
細胞發生凋亡時，DNA發生特征性的核小(xiǎo)體(tǐ)間的斷裂，産(chǎn)生大小(xiǎo)不同的片段，但都是180~200bp的整數倍，在凝膠電(diàn)泳上表現為(wèi)梯形電(diàn)泳圖譜(DNA ladder)。細胞經處理(lǐ)後，采用(yòng)常規方法分(fēn)離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠電(diàn)泳和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中(zhōng)可(kě)觀察到典型的DNA ladder。
3.彗星電(diàn)泳法
彗星電(diàn)泳的原理(lǐ)是将單個細胞懸浮于瓊脂糖凝膠電(diàn)泳中(zhōng)，經裂解處理(lǐ)後，産(chǎn)生大小(xiǎo)不同的片段，再在電(diàn)場中(zhōng)進行短時間的電(diàn)泳，并用(yòng)熒光染料染色，凋亡細胞中(zhōng)形成的DNA斷裂片段，在電(diàn)場中(zhōng)遊動速度較快，使細胞核呈現出一種彗星式圖案。
4.TUNEL測定法
即DNA斷裂的原位末端标記法，細胞凋亡中(zhōng)，染色體(tǐ)DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而産(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可(kě)在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶的作(zuò)用(yòng)下，将脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物(wù)酶、堿性磷酸酶或生物(wù)素形成的衍生物(wù)标記到DNA的3'-OH末端，從而可(kě)進行凋亡細胞的檢測。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有(yǒu)DNA的斷裂，因而沒有(yǒu)3'-OH形成，很(hěn)少能(néng)夠被染色。可(kě)用(yòng)于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中(zhōng)分(fēn)離的細胞的形态測定，并可(kě)檢測出極少量的凋亡細胞。
5.流式細胞分(fēn)析法
磷脂酰絲氨酸（PS）正常位于細胞膜的内側，但在細胞凋亡的早期，PS可(kě)從細胞膜的内側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中(zhōng)。Annexin-V是一種分(fēn)子量為(wèi)35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能(néng)與PS高親和力特異性結合。将Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin标記，以标記了的Annexin-V作(zuò)為(wèi)熒光探針，利用(yòng)流式細胞儀或熒光顯微鏡可(kě)檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一種核酸染料，它不能(néng)透過完整的細胞膜，但在凋亡中(zhōng)晚期的細胞和死細胞，PI能(néng)夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此将Annexin-V與PI匹配使用(yòng)，就可(kě)以将凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分(fēn)開來。
6.Countstar Rigel 檢測法
結合Annexin-V FITC和PI染色液，對細胞樣品進行處理(lǐ)，然後在Rigel 儀器上進行檢測，然後流式分(fēn)析導出，在FCS類流式軟件上進行分(fēn)析，得到散點圖結果。
其實驗步驟如下：
①每個樣品收集約30~50萬個細胞于1.5毫升離心管内（如細胞密度為(wèi)100 萬個/mL，則取500微升體(tǐ)積懸液用(yòng)于後續實驗）；将細胞在400g轉速條件下離心3分(fēn)鍾，棄上清，用(yòng)200微升PBS進行重懸；用(yòng)移液槍輕輕吹打混勻，400g轉速條件下離心3分(fēn)鍾，棄上清，用(yòng) 100 微升Annexin V Binding Buffer重懸；
②向細胞懸液中(zhōng)加入1.5微升Annexin-V-FITC染色液；
③加入4微升PI染色液；
④混勻，室溫避光孵育10~15分(fēn)鍾；
⑤400g轉速條件下離心3分(fēn)鍾，棄上清，用(yòng)100微升Annexin V Binding Buffer進行重懸；
⑥400g轉速條件下離心3分(fēn)鍾，棄上清，用(yòng)100微升Annexin V Binding Buffer進行重懸；
⑦在30分(fēn)鍾内完成檢測，檢測之前，避光保存。吸取20微升懸液，加入細胞計數闆，插入儀器樣品槽裏，選擇“細胞凋亡”實驗類型，進行檢測；流式分(fēn)析導出，在FCS軟件上進行分(fēn)析，如圖1和2。
圖1.A Rigel 檢測的凋亡熒光圖片結果；B FCS軟件分(fēn)析得到的散點圖；C 細胞不同狀态所占比
圖2. Rigel所攝凋亡細胞檢測圖片
（PS: 僅限于研究用(yòng)途， 不可(kě)用(yòng)于診斷操作(zuò)）
