技(jì )術背景
采用(yòng)動物(wù)細胞培養技(jì )術生産(chǎn)流感疫苗，是将病毒接種到傳代細胞，并在生物(wù)反應器中(zhōng)大規模進行病毒繁殖以實現流感疫苗的規模化生産(chǎn)。目前，為(wèi)滿足日益增長(cháng)的全球流感疫苗需求，提高工(gōng)藝效率的研究工(gōng)作(zuò)勢在必行。
MDCK細胞系可(kě)以用(yòng)于多(duō)種病毒的繁殖和純化，如流感病毒，RSV，副流感病毒1、2和 3，呼吸道合胞病毒，乳多(duō)空病毒，水泡性口膜炎病毒，痘苗病毒，柯薩奇病毒，呼腸弧病毒，細小(xiǎo)病毒，腺病毒，骨髓灰質(zhì)炎病毒，麻疹病毒，狂犬病病毒和疱疹病毒。尤其可(kě)用(yòng)于流感病毒增殖。流感病毒在細胞内的擴增必然會受到感染時的細胞生理(lǐ)狀态的影響。生理(lǐ)狀态良好的細胞有(yǒu)利于病毒的感染複制，可(kě)提高流感病毒在細胞内的擴增效率。細胞在生長(cháng)過程中(zhōng)其生理(lǐ)狀态是随時間不斷變化的，其生産(chǎn)病毒的能(néng)力也會随之發生相應改變。因此，考察細胞在何時處于感染複制病毒的最佳生理(lǐ)狀态成為(wèi)一個關鍵研究點。
接種病毒後MDCK細胞檢測遇到的問題
MDCK細胞在接種病毒後濃度活率的檢測有(yǒu)利于監測細胞狀态，成為(wèi)确定收獲病毒時間的重要指标。在接種病毒第二天後，MDCK細胞聚團嚴重，采用(yòng)常規的台盼藍計數方法不能(néng)有(yǒu)效檢測細胞的濃度與活率。因為(wèi)聚團導緻活細胞識别不準确，導緻活率偏低很(hěn)多(duō)。如A圖：
A.台盼藍染色方法
若采用(yòng)熒光計數方法，對細胞核有(yǒu)效染色計數，能(néng)得到準确的結果。如B圖:
B.熒光染色方法
MDCK細胞培養過程中(zhōng)存在很(hěn)嚴重的“失巢凋亡”現象-Anoikis，它是一種細胞程序死亡形式，是由于細胞與細胞外基質(zhì)和其他(tā)細胞脫離接觸而誘發的，即細胞一旦不黏附其它基質(zhì)就會發生凋亡。這也同樣印證細胞活率高時細胞的黏附力強，結團就相對嚴重。
在第三天檢測接種病毒的MDCK細胞，明顯細胞活率下降很(hěn)多(duō)，同時結團率也下降。同時由于細胞碎片的大量産(chǎn)生給細胞計數濃度與活率帶來困難。所以采用(yòng)熒光染色方法是檢測此類特殊樣本的有(yǒu)效方法。熒光染料隻對核酸進行染色，從而特定排除細胞碎片的幹擾。
C.熒光染色方法
總結與建議
1. 懸浮培養接種流感病毒的MDCK，特定培養天數時的結團率高，可(kě)在收獲細胞時添加少量的胰酶消化細胞，盡可(kě)能(néng)的得到單細胞懸液。
2. 漩渦振蕩器不能(néng)将結團率高的細胞懸液很(hěn)好混勻，可(kě)以采用(yòng)移液器多(duō)吹打混勻，再計數效果好。
3. 對于特殊的細胞樣本，例如此類接種病毒的細胞，以AOPI熒光染色為(wèi)好，台盼藍染色不能(néng)很(hěn)好的區(qū)分(fēn)碎片，雜質(zhì)。
