2018年9月,美國(guó)藥典(USP-NF)出台了關于細胞冷凍保存的政策,文(wén)中(zhōng)明确提出,對于凍存複蘇的樣本,類似于台盼藍的染料來檢測細胞完整性的方法用(yòng)的越來越少,因為(wèi)其不能(néng)很(hěn)好的辨别凍存和複蘇的細胞,這種檢測方法經常需要特定細胞種類并且指定合适的濃度和時間。當下熒光染料越來越多(duō)的應用(yòng)于複蘇細胞的濃度活率檢測。USP-NF建議至少選用(yòng)兩種方法對複蘇後的細胞進行活率檢測。詳情請參考《USPGeneral Chapter <1044> Cryopreservation of Cells》。
凍存複蘇的過程中(zhōng),細胞損傷是不可(kě)避免的,細胞濃度活率計數在凍存和複蘇的各個環節至關重要。例如,如果凍存前的細胞濃度或活率過低,會導緻細胞複蘇後生長(cháng)緩慢或者無法生長(cháng)。目前細胞計數方法主要是台盼藍染色法計數、庫爾特法及熒光染料法計數。其中(zhōng)台盼藍染色方法,因為(wèi)其對蛋白質(zhì)有(yǒu)很(hěn)強的親和力,需要用(yòng)到不含血清的稀釋液效果才會更好;另外,剛複蘇的樣本,台盼藍染色結果不穩定。庫爾特法主要是根據細胞大小(xiǎo)來區(qū)分(fēn)細胞活率,更适合于純的細胞系的檢測。
實際實驗過程中(zhōng),很(hěn)多(duō)客戶也碰到凍存複蘇的樣本活率計數問題。下面我們根據藥典的建議,對凍存複蘇的樣本活率計數的問題進行解析和實驗證明。
01
細胞存儲方法
細胞凍存是細胞保存的主要方法之一,主要用(yòng)于細胞保種,同時也可(kě)用(yòng)于購(gòu)買、寄贈、交換和運輸。近年來,幹細胞的研究越來越被人們關注,當下最熱門的就是将自身或異體(tǐ)的健康的幹細胞儲存起來,可(kě)以在自身或親屬患病時啓用(yòng)細胞治療的方法,使一些病症能(néng)得到有(yǒu)效治療,為(wèi)生命儲存一份保險。目前長(cháng)期存儲的方式大多(duō)采用(yòng)-196度的液氮保存。
02
細胞凍存複蘇過程中(zhōng),影響細胞活力的因素
直接凍存細胞時,細胞内和外環境中(zhōng)水都會形成冰晶,能(néng)導緻細胞内發生冰晶損傷、電(diàn)解質(zhì)升高、脫水、蛋白變性等,能(néng)引起細胞死亡。所以在細胞凍存液中(zhōng)必須要加入冷凍保護液,通過降低冰點,然後在緩慢凍結的條件下使水份在凍結前透出細胞,最後存儲在-130℃以下來減少冰晶的形成,從而保護細胞中(zhōng)一些重要的蛋白質(zhì)和細胞器的功能(néng)。常用(yòng)的保護劑主要是二甲亞砜(DMSO)和甘油。細胞複蘇的時候要快速,讓細胞迅速通過細胞最易受損的-50-0℃,從而保證細胞仍然可(kě)以生長(cháng)、活力受損不大。
細胞凍存過程的制約因素:
1、需要存儲的細胞狀态,處于指數生長(cháng)期、密度合适、狀态好的樣本凍存複蘇效果好一些;所以凍存前的細胞需要确定其活率和濃度;
2、程序性降溫步驟的控制,即冷凍速度的控制,過慢會導緻細胞外溶質(zhì)損傷,過快則會導緻細胞内産(chǎn)生冰晶;
3、凍存過程細胞無污染;
4、冷凍保護劑的選擇。
細胞複蘇過程的制約因素:
1、37℃水浴,在1-2分(fēn)鍾内快速解凍,使細胞内不會形成較大的冰晶,也不會暴露在高電(diàn)解質(zhì)的溶液中(zhōng)過長(cháng),從而繼續保持正常的結構和功能(néng);
2、冷凍保護劑的去除,例如常溫下,DMSO對細胞毒性作(zuò)用(yòng)比較大。
03
利用(yòng)台盼藍和AO/PI熒光染料法來精(jīng)确測量凍存複蘇的細胞樣本
1、AO/PI染色法檢測原理(lǐ)
吖啶橙(Acridine orange,AO)和碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)都可(kě)以對死、活細胞核中(zhōng)的DNA進行染色。染色原理(lǐ)如圖1所示。該方法可(kě)以有(yǒu)效區(qū)分(fēn)死細胞和碎片,以及減少細胞折光率改變對染色效果的影響。
圖1:AO/PI染色法檢測原理(lǐ)
2、培養過程中(zhōng)及凍存複蘇後MSC細胞計數
培養過程中(zhōng),MSC細胞台盼藍染色方法與AO/PI染色方法結果對比如圖2和表1所示。
圖2. 培養過程中(zhōng)MSC細胞AO/PI及台盼藍計數結果原始圖片
表1. 培養過程中(zhōng)MSC細胞AO/PI及台盼藍計數濃度及活率對比
結論:培養過程中(zhōng)MSC細胞AO/PI及台盼藍計數濃度及活率無明顯差異。
凍存複蘇的ASCs細胞台盼藍染色方法與AO/PI染色方法結果對比如圖3和表2所示。
圖2. 凍存複蘇的ASCs細胞AO/PI及台盼藍計數結果原始圖片
表2. 凍存複蘇的ASCs細胞AO/PI及台盼藍計數濃度及活率對比
結論:對于本次實驗樣本,凍存複蘇的ASCs細胞AO/PI計數結果細胞活率明顯低于台盼藍計數,圖片中(zhōng)也可(kě)以看出,AO/PI計數死活細胞區(qū)分(fēn)更加明顯,而台盼藍計數結果中(zhōng)有(yǒu)些碎片和台盼藍染色不明顯的細胞無法區(qū)分(fēn)。
3、 運輸過程中(zhōng)的ASCs細胞台盼藍染色方法與AO/PI染色方法結果對比如圖4和表3所示。
圖4. 運輸前後的ASCs細胞AO/PI及台盼藍計數結果原始圖片
表3 運輸前後的ASCs細胞AO/PI及台盼藍計數活率對比結果
結論:運輸前細胞狀态好,台盼藍與AO/PI計數結果無明顯差異;運輸後的細胞樣本,台盼藍計數結果與運輸前無明顯差異,但是AOPI計數結果明顯低于台盼藍計數;從圖4中(zhōng)也可(kě)以明顯觀察到,運輸後的樣本中(zhōng),台盼藍染色的圖片中(zhōng)有(yǒu)些細胞被台盼藍染色非常淺,肉眼判斷死活非常困難。
綜上,從上述實驗結果中(zhōng)觀察到,不管是培養過程中(zhōng)還是運輸前的狀态比較好的細胞樣本,台盼藍計數與AO/PI熒光計數結果細胞活率保持一緻;但對于凍存複蘇及運輸後複蘇的樣本,AO/PI活率明顯比台盼藍計數結果低。類似的實驗結果在很(hěn)多(duō)地方得到驗證,活率計算結果差異大小(xiǎo)依據凍存效果不同有(yǒu)所波動。所以對于凍存複蘇的樣本,選擇countstar Rigel AO/PI熒光方法計數能(néng)更精(jīng)确的區(qū)分(fēn)凍存複蘇細胞死活,從而反映更加真實的細胞活力狀态,實驗人員可(kě)以根據實際情況選擇最适的計數方法。
04
總結
1、上述實驗結果證明,細胞狀态好的樣本,用(yòng)台盼藍計數與AO/PI兩種方法計數得到的細胞活率結果一緻;
2、複蘇後的樣本中(zhōng),一些狀态不好的細胞台盼藍染色可(kě)能(néng)不太清晰,台盼藍染色特異性不太好,計數結果可(kě)能(néng)會帶來較大的誤差,使用(yòng)AO/PI雙熒光法計數,死、活細胞區(qū)分(fēn)更加清晰,可(kě)以得到更加精(jīng)确的結果;但是兩種方法計數活率差異程度也會依賴于凍存方法和凍存前的細胞狀态等。
3、我們通過實驗驗證了美國(guó)藥典1044期中(zhōng)強調的凍存複蘇細胞活率計數問題。對于凍存複蘇的細胞活率檢測,現在越來越多(duō)的應用(yòng)熒光的方法,建議大家至少選用(yòng)兩種方法對複蘇後的細胞進行活率檢測。
(PS: 僅限于研究用(yòng)途, 不可(kě)用(yòng)于診斷操作(zuò))