微生物(wù)發酵過程是非線(xiàn)性、非結構化、偶然性強的複雜系統。了解這些過程的動态變化需要首先監測細胞生長(cháng)。雖然已經有(yǒu)了一些基于離線(xiàn)樣品的準确分(fēn)析技(jì )術，但是為(wèi)了自動化建模、控制和優化工(gōng)藝過程，穩健的在線(xiàn)監測手段就顯得十分(fēn)必要。在這項研究中(zhōng)，我們使用(yòng)五種不同的傳感器技(jì )術，即近紅外吸收（NIR）、非侵入式光散射、反向散射、介電(diàn)光譜和尾氣分(fēn)析，應用(yòng)于谷氨酸棒狀杆菌生長(cháng)的在線(xiàn)監測。 我們也研究了不同的傳感器在發酵的生長(cháng)穩定期，不同的攪拌速率和通氣條件下的表現。本研究主要目的是了解不同傳感器用(yòng)于在線(xiàn)監測細菌發酵和評估細菌生長(cháng)速率的優勢以及局限性，對于産(chǎn)物(wù)的信息并沒有(yǒu)評估。
實驗使用(yòng)用(yòng)谷氨酸棒狀杆菌WT菌株ATCC13032。實驗裝(zhuāng)置（如圖 1）有(yǒu) Lucullus（Securecell，瑞士）和EVE生物(wù)工(gōng)藝平台設備（瑞士，Infors）作(zuò)為(wèi)工(gōng)藝監控和記錄的信息管理(lǐ)系統。使用(yòng)Hamilton EasyFerm Plus Arc 325 mm pH 電(diàn)極（Hamilton，瑞士）在線(xiàn)測量将 pH 值保持在 7.0并根據需要添加堿（4 M KOH）和酸（磷酸(10%, w/v))。消泡劑 (AF) 溶液 Antifoam 204 (Sigma Aldrich)，需要時手動添加到生物(wù)反應器中(zhōng)。加熱/冷卻元件由一個玻璃雙層夾套組成，系統的溫度 (T) 在 30°C。HamiltonVisiFerm DO Arc 325 mm (Hamilton, Switzerland) 在線(xiàn)測量氧分(fēn)壓 (pO2)。質(zhì)量流量控制器(MFC) 提供并控制恒定的 2 Lmin- 1 氣流。OD是通過 UV-VIS 分(fēn)光光度計 (UV-160A;島津）進行測量。
Numera 系統（Securecell，瑞士）從生物(wù)反應器中(zhōng)進行自動采樣。其取樣計劃由Lucullus (Securecell, 瑞士)進行編輯。之前的研究表明Numera系統的稀釋程序對細胞活力和細胞碎片沒有(yǒu)影響，各種分(fēn)析物(wù)的監測沒有(yǒu)明顯的誤差，并且Numera 系統的準确性比拉曼光譜法 [29] 等線(xiàn)性方法好一個數量級。Numera系統的硬件由多(duō)路複用(yòng)模塊、稀釋模塊和一個過濾模塊（圖 1）組成。多(duō)路複用(yòng)模塊從不同的生物(wù)反應器吸取樣品并轉移到稀釋模塊中(zhōng)，樣品和HPLC級純水以 1:10 的比例稀釋。然後樣品被注入樣品存貯器的小(xiǎo)瓶在 5°C下保存。在本研究中(zhōng)，首先進行了專門的實驗确認光密度和細胞幹重的線(xiàn)性關系（參見附錄圖 A.10）。比較 OD 測量值和傳感器信号的關系，我們使用(yòng) NUMERA 系統在計劃好的時間自動吸取1mL的樣品，并使用(yòng)此樣品測量 OD 或 CDW。
圖表1 谷氨酸棒狀杆菌發酵的示意圖 整個系統包含（1）添加堿/酸、消泡劑、糖的泵 ，（2）允許料液流入反應器的入口，（3）空氣閥，（4）空氣質(zhì)量流量控制器，（5）設定好阈值的pH控制器，（6）原位傳感器（綠色），（7）加熱/冷卻部件，（8）設定好阈值的溶氧控制器，（9）設定好阈值的溫度控制器，（10）外部的生物(wù)量傳感器，（11）氣體(tǐ)的多(duō)路閥，（12 ）監測O2和CO2濃度的傳感器。液體(tǐ)樣品（綠色虛線(xiàn)）由Numera自動取樣系統吸取。Numera的組成包括（13）多(duō)路複用(yòng)模塊可(kě)以從不同的反應器中(zhōng)進行取樣，（14）稀釋模塊，稀釋樣品并傳輸到（15）過濾模塊進行過濾或者是（16）樣品存貯器進行低溫保存
本次研究使用(yòng)的五種技(jì )術的六個傳感器如下表
表格1 傳感器名(míng)稱、測量原理(lǐ)、采樣頻率、靈敏度、信号窗口（w1）和導數窗口（w2）
本研究的目的是評估不同的傳感器技(jì )術用(yòng)于谷氨酸棒杆菌實時生長(cháng)監測。測試的傳感器具(jù)有(yǒu)不同的測量原理(lǐ)、靈敏度和采樣頻率，包括 NIR 吸光度、非侵入式光散射、反向散射、介電(diàn)光譜（電(diàn)容）和尾氣傳感器測量。同時也評估了通氣情況和攪拌速率對不同傳感器靈敏度的影響，發現攪拌速率會影響所有(yǒu)傳感器。其中(zhōng)電(diàn)容式傳感器對攪拌速度特别敏感，該效果歸因于相對小(xiǎo)的生物(wù)反應器規模。不同傳感器和離線(xiàn)光密度測量之間的線(xiàn)性回歸和多(duō)元線(xiàn)性回歸分(fēn)析，使我們能(néng)夠準确的預估生物(wù)反應器的谷氨酸棒杆菌生長(cháng)。另外，所研究的傳感器表現出穩态噪聲，影響了時間導數的計算。通過運用(yòng)高斯濾波器過濾噪聲，證明了這些技(jì )術也能(néng)夠準确的進行生長(cháng)速率評估。
